安祖花的外植體選擇技術研究

材料與方法

實驗材料

材料來源於河南省濟源市農業科學研究所栽培的火焰。

組培快繁方法

外植體的選取:取安祖花的莖尖、葉片、肉穗花序、佛焰苞等爲外植體材料。

外植體的消毒方法:將外植體用洗潔精清洗半小時，再用水沖洗乾淨後，放在超淨工作臺上無菌條件下，用75%酒精分別侵泡30s、60s；在放入0.1%的昇汞溶液中分別侵泡5min、20min、40min、60min，然後用無菌水沖洗5次~6次，接種於啓動培養基中。接種15天后調查各自污染率及褐化率，選取最佳外植體部位。

褐化的克服

選用不同年齡的葉片，用不同的方法進行切割對比。

結果與分析

外植體的選擇

外植體的污染克服

在安祖花組織培養中，外植體的選擇決定着消毒、褐化、誘導的快與慢、成功與失敗，是整個組培工序的開始和基礎，因而至關重要。如外植體的選擇不當，會導致實驗無法進行或緩慢。在不同季節中，採取莖尖、葉片、肉穗花序、佛焰苞爲外植體，在無菌條件下對它們分別進行表面處理，結果請見表1:

首先，我們從表中可看到芽和花序在長時間消毒的情況下，污染率達到100%，而幼嫩葉片在較短的消毒時間內污染率僅爲20%。安祖花爲熱帶雨林植物，由於常年生長在高溫高溼的環境中，空氣溼度大，在莖、葉表面滋生大量的微生物，並附着大量的黴孢子和細菌芽孢，甚至一些菌絲侵入表皮內的薄壁組織，因此較難消除污染。其次，材料引種多年，有可能材料中具有內生的微生物，而存在的部位不同。安祖花的內生微生物可能存在其他部位而不是在葉片上，因此葉片爲我們這次實驗的最佳外植體。

褐化的克服

安祖花屬熱帶草本植物，體內含酚類物質多，多酚氧化酶的活性高。在組培中外植體發生較嚴重的褐化。褐化成爲十分重要的問題，不解決褐化，愈傷，芽就難以誘導，組培成功率極小。總結前人研究經驗，在莖尖、葉片、根尖等外植體中，0.3cm的莖尖和1cm×1cm的葉片褐化較輕，分化較好，是較好的外植體選擇[2][3]。爲此對葉片進行進一步的研究，不同安祖花品種葉片生長速度不同，不同品種葉片愈傷誘導的難易程度不同，多數品種在葉片轉青期的愈傷誘導率較高[4]。爲此進行了不同葉齡的外植體的比較，結果請見表2：

從表2中可見，剛從葉鞘內抽出的捲曲葉爲外植體時，雖然污染率和褐化率極小，但由於組織形態未發育完全，其誘導率爲零。隨着葉領的增大，污染率逐漸增大，褐化率相應增大，而愈傷誘導率逐漸增加。說明較嫩的組織中多酚氧化酶少，酚等次生物質少且分生能力強，因此外植體以剛展開葉片1周~2周爲最佳選擇。

討論

植物組織培養的成功，除人爲提供適宜培養基之外，外植體的選用很重要。像安祖花的初代培養時實驗了幾種外植體，實驗表明除葉片污染率小外，其他均超過50%的細菌污染率，因此懷疑是內生微生物所爲。採用以葉爲外植體進行培養時，再生植株有一個從分化狀態，回覆到分生組織狀態的脫分化過程。因而要在多種生長素和細胞分裂素的配合下才有利於葉組織分化和再分化。

在用葉片作爲外植體時，爲消除安祖花特有的褐化現象，接種時要採用撕裂葉片的方式，而不是用剪刀切割，以減少多傷口的傷害。用剛展葉第1周、2周的幼嫩葉爲外植體，因爲幼年的組織比老年的組織具有較高的形態發生能力，而且引起褐化的酚類物質含量少。外植體的大小和接種部位也非常重要，像葉片爲外植體，不能太大，也不能太小，太大易污染，太小存活率低，以1cm×1cm爲最佳。外植體的不同器官或器官上的部位不同發生能力也不相同。在實驗中我們發現安祖花的幼嫩葉片比老葉片再生能力強。葉基部靠近葉柄處，葉脈集中的部位再生能力強，並且以葉背面接觸培養基的效果最佳。

總之，安祖花以葉片爲外植體接種時，選擇剛展開葉第1周、2周新葉，經表面消毒後，將葉片基部靠近葉柄部分撕成1cm×1cm大小快，以葉背面接觸培養基，進行愈傷組織的誘導爲最佳。